在您的科研生涯的某個時候，都有可能會用到熒光顯微鏡。這種無處不在的技術改變了顯微鏡學家對研究對象進行成像、標記和追蹤的方式，不論是整個生物體，還是單個蛋白質(zhì)等等。
通過本文，我們將探討什么是“熒光"，包括其定義背后的歷史和基礎物理原理，綠色熒光蛋白（GFP）的發(fā)現(xiàn)和應用，并展望量子點等熒光探針不斷擴大的應用領域。


我們?nèi)绾味x“熒光"？
在任何搜索引擎中輸入“熒光的定義"，你會得到以下語句，或者非常相似的內(nèi)容；
“由較短波長的入射輻射，如X射線或紫外線，某些物質(zhì)會發(fā)出可見或不可見的輻射。"
這個定義與熒光顯微鏡（圖1）有何關聯(lián)呢？“波長較短的入射輻射"只是用來“激發(fā)"樣品發(fā)射熒光的光源。這種光線包括可見光、紫外線（UV）和紅外線（IR），顯微鏡的光源可以是汞或氙弧光燈，也可以是激光。熒光基團（即上述定義中的“某些物質(zhì)"）是具有特殊性質(zhì)的化合物，它們在較短波長光線的激發(fā)下，可以再次發(fā)射較高波長的光線/光子。

 
圖1：熒光顯微鏡下顯示的熒光標記細胞。
波長的基本單位是米，“波長"定義為光波的兩個連續(xù)波峰或波谷之間的距離。波長的符號是希臘字母λ(l)。顯微鏡使用的波長通常以納米（nm）為單位，可見光譜段在400至700納米之間，紫外光譜段在400納米以下，紅外光譜段從700納米開始（圖2）。

 
圖2：可見光光譜
熒光基團按其激發(fā)和發(fā)射波長分類，通常以圖形的形式顯示最大波峰。熒光基團在所謂的“基態(tài)"中自然穩(wěn)定。它們吸收到（來自“較短波長"入射光的）光子時，光子的能量將熒光基團的電子提升到更高能量的“激發(fā)"狀態(tài)。被激發(fā)的電子不會保持在這種狀態(tài)，而會失去振動能量，并在返回基態(tài)時發(fā)射出一個較長波長的光子。對于顯微鏡使用熒光基團，從激發(fā)到返回基態(tài)的一個完整周期需要0.5到20納秒。
熒光基團的激發(fā)和發(fā)射波長通常縮寫為希臘字母lambda，加上下標“ex"（激發(fā)）或“em"（發(fā)射；即lex或lem）。
每個熒光基團都有一個不同的最大激發(fā)和發(fā)射譜段，這一特性用來區(qū)分同一樣品中的不同標靶。例如，使用熒光染色劑DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚）高亮顯示細胞中的核蛋白，同時使用熒光標記的鬼筆環(huán)肽來高亮顯示肌動蛋白細胞骨架。
熒光的雅布隆斯基圖
波蘭物理學家亞歷山大·雅布隆斯基（Aleksander Jablonski，1898-1980）首先用三能級能量圖描述了基態(tài)/激發(fā)/發(fā)射之間的循環(huán)，因此稱為“雅布隆斯基圖"。  1930年，他憑借題為《關于激發(fā)光波長變化對熒光光譜的影響》的論文獲得華沙大學博士學位。1933年，他在《自然》雜志上發(fā)表了自己的論文（《染料中反斯托克斯熒光的效率》"），其中含有雅布隆斯基圖。這種簡單而有效的示意圖清晰表現(xiàn)出熒光基團從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的激發(fā)行為，然后在發(fā)射較長波長光子后回到基態(tài)（圖3）。

 
圖3：熒光雅布隆斯基圖。熒光基團會吸收光子。光子的能量將熒光基團的電子提升到更高能量的“激發(fā)"狀態(tài)。隨后，激發(fā)的電子失去振動能量，并在返回基態(tài)時發(fā)射一個較長波長的光子。
 
雖然圖3是簡化版的雅布隆斯基圖，但應該可以注意到，熒光基團可以存在多個不同的激發(fā)和發(fā)射狀態(tài)。此外，熒光基團可以通過不同的弛豫狀態(tài)返回基態(tài)，這些弛豫狀態(tài)被稱為“三重態(tài)"，具體取決于分子的電子自旋。
斯托克斯位移
喬治·加布里埃爾·斯托克斯爵士（1819-1903）是愛爾蘭數(shù)學家和物理學家，他一生中在光學和光線領域頗有建樹。1849年他受命擔任劍橋彭布羅克學院的盧卡斯數(shù)學教授，并一直擔任該職務，直到1903年離開。他寫了一篇文筆優(yōu)美的描述性論文，發(fā)表于1852年，名為《論光的折射性的變化》[1]。他在論文中使用的語言不同于我們在現(xiàn)代科學文獻中使用的語言。以下是斯托克斯爵士所用精彩語言的兩段簡短摘錄；
“去年深秋，雖然因為節(jié)氣遲來，觀察機會不多，我從不同渠道得知，之前提到過的那種具有高內(nèi)色散性的黃色玻璃采用氧化鈾染色。"
以及：
“看到試管在浸入不可見光線的瞬間點亮，這當然是一個奇怪的景象：那實際上是可見的黑暗。總的來說，這種現(xiàn)象有點不可思議。"
“斯托克斯位移"這詞就是為了紀念這位科學家。當激發(fā)的電子回到基態(tài)并發(fā)出光子時，其波長始終大于激發(fā)熒光基團的入射光線的波長。這是由于光的特性，即波長與輻射能量成反比。斯托克斯位移描述了熒光基團的峰值激發(fā)波長和峰值發(fā)射波長之間的差值（以納米為單位）（圖4）。

 
圖4：斯托克斯位移發(fā)射光的波長始終大于用來激發(fā)熒光基團的光線波長。
增加斯托克斯位移，熒光基團的激發(fā)光和發(fā)射光之間區(qū)別就越明顯。熒光基團的電子排布和分子結(jié)構(gòu)令其在斯托克斯位移方面有著*的性質(zhì)。
綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)與應用
斯托克斯爵士首先使用“熒光"這個術語來描述他觀察到的現(xiàn)象，但其發(fā)現(xiàn)可以追溯到1565年。來自西班牙的醫(yī)生兼植物學家尼古拉斯·莫納德斯（Nicolas Monardes）描述了一種墨西哥樹（Lignum nephriticum），其木頭被注入了奇怪的藍色。盡管有這些早期的觀察，但直到約400年后，人們才在活體組織中找到一種綠色熒光物質(zhì)。1955年，Davenport和Nicol發(fā)表論文[2]，描述了一種在稱為水螅水母（Hydromedusae）的水母亞綱生物的嗜酸性粒細胞中找到的發(fā)光組織。當時，兩位論文作者并沒有意識到這些嗜酸性粒細胞含有綠色熒光蛋白（GFP）。
直到1962年，下村脩（Osamu Shimomura，出生于1928）發(fā)表了一篇論文[3]，認定這種發(fā)光成分是一種蛋白質(zhì)。通過與他在普林斯頓大學的老師（弗蘭克·*教授）合作，他們從生物發(fā)光水母Aequorea Victoria（維多利亞多管發(fā)光水母）身上收集到樣本。他們用一種*的方法從水母中分離出熒光蛋白，即通過棉布袋擠壓分離的生物發(fā)光組織，產(chǎn)生一種被下村稱為“擠壓物"的溶液。
1994年，哥倫比亞大學的馬丁·查爾菲（Martin Chalfie，出生于1947年）教授發(fā)表論文，證明了基因編碼GFP可以在原核細胞和真核細胞（即大腸桿菌和秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)元）中實現(xiàn)功能表達[4]。該論文寫道“由于這種熒光不需要外源底物和輔助因子，GFP表達可以用于監(jiān)測生物體內(nèi)的基因表達和蛋白質(zhì)定位。"正是這篇文章的發(fā)表為GFP在生物學研究中的廣泛應用鋪平了道路。

 
圖5：線蟲，GFP在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達。
一年后，一直在研究野生型GFP突變體的加州大學圣迭戈分校教授錢永健（1952-2016）在《自然》的科學通訊上發(fā)表了自己的論文[5]。錢教授和他的同事發(fā)現(xiàn)，他們選擇的一個單點突變（S65T）具有最長的激發(fā)和發(fā)射波長(490/510nm)，這令它更具有光穩(wěn)定性，并帶來大家都知道的GFP激發(fā)/發(fā)射峰。
2008年，下村脩、錢永健和查爾菲因在GFP的發(fā)現(xiàn)和應用方面發(fā)揮的重要作用共同獲得諾貝爾化學獎。下村脩在他的諾貝爾演講中表示，“當我在1979年發(fā)現(xiàn)GFP的發(fā)色團時，我認為自己已經(jīng)完成了所有研究工作，因而決定終止我在GFP方面的工作，以便集中精力研究生物發(fā)光"。他接著承認，“GFP是一種美麗的蛋白質(zhì)，但在發(fā)現(xiàn)之后的30年中，它依然百無一用。"
自從錢永健發(fā)現(xiàn)GFP的應用之后，他的實驗室已經(jīng)設計出多種GFP變體，涵蓋了大部分的可見光譜，并*改變了光學顯微鏡和成像領域。得益于這種基因工程，GFP的色彩范圍從光譜的藍色譜段（EBFP；380/460納米）到光譜的黃色譜段（YFP；514/527納米）。
報告基因和探針
除了成像領域，熒光團可以作為研究細胞和生物體中基因表達的“報告基因"。熒光素酶以及基因編碼GFP，就是檢查細胞是否表達特定基因的常用報告基因。生物體或細胞被基因改造的病毒DNA或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，當目標基因獲得表達時，這些質(zhì)粒會發(fā)出熒光。細胞內(nèi)部的相關細胞器或位點可以在受轉(zhuǎn)染的細胞中進行觀察和檢查。
利用熒光基團標記（或“標注"）的抗體通常稱為“熒光探針"。在GFP和其他熒光基團得到廣泛應用之前，兩種常用的熒光基團標記抗體是FITC（異硫氰酸熒光素）和TRITC（異硫氰酸四甲基羅丹明）。盡管FITC和TRITC仍在使用，但該領域已取得重大進展，至少可以說，熒光基團和探針的選擇非常廣泛。
當然，如今實驗室中使用最為廣泛的熒光基團之一是“Alexa Fluor"染色劑。目前Alexa Fluor染色劑的可用色彩范圍已超越可見光譜，其中激發(fā)波長范圍可達346至784納米。
量子點
1981年，俄羅斯科學家阿列克謝·埃基莫夫（Alexey Ekimov）在圣彼得堡瓦維洛夫國立光學研究所工作時，第一次在玻璃基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了量子點。然而，在新澤西州AT&T貝爾實驗室從事半導體工作的路易斯·布魯斯（Louis Brus）首先發(fā)現(xiàn)了量子點膠體溶液。他現(xiàn)在是哥倫比亞大學化學系教授。在1983年和1984年發(fā)表的兩篇論文中，布魯斯將量子點描述為“小型半導體微晶"。
量子點有著奇特的行為方式，盡管它們包含100到10萬個原子，但它們表現(xiàn)出的性質(zhì)就像它們由單個原子組成一樣。當然，它們確實符合熒光基團的性質(zhì)，即它們可以吸收光能并激發(fā)，然后在返回基態(tài)時釋放光子。不過，量子點發(fā)射光線的波長取決于量子點的大小，即量子點越小，發(fā)射波長就越短。這種特性是因為較小的量子點具有較大的“最小帶隙"。這正是激發(fā)電子到更高能態(tài)所需的能量。由于較小的量子點需要更多的激發(fā)能量，它們隨后會發(fā)射較短波長的光（波長與激發(fā)能量成反比）。
大約20年后，即2002年，加州量子點公司的生命科學研究人員實現(xiàn)了量子點的商用開發(fā)。
量子點是一種非常明亮且穩(wěn)定的熒光工具。研究表明，量子點的的亮度比傳統(tǒng)熒光基團高幾個數(shù)量級，盡管與有機染料相比，量子點的明亮程度存在一些差異[6]。就光穩(wěn)定性而言，量子點的穩(wěn)定性是傳統(tǒng)熒光基團的100倍，在一項活體成像研究中，量子點的熒光持續(xù)時間長達4個月[7]。
在傳統(tǒng)熒光探針中，一個或多個熒光基團可以附著在單個相關抗體上。然而，由于量子點的表面積非常大，許多分子和抗體可以附著在單個量子點上，這會帶來許多優(yōu)點，包括熒光信號放大。量子點的使用也為多重分析提供了優(yōu)勢，可以在檢測中同時對各種波長進行成像。在這種分析中，變量是研究者選擇的量子點大小（因此發(fā)射波長）。可以使用白光同時激發(fā)大范圍的量子點，這樣就可以避免使用多道激光和多次調(diào)整來形成最終影像。